Examen direct (microscopie des bactéries et des mycobactéries)
Introduction:
L’examen direct est une approche rapide mais ne donnant généralement qu’une indication préliminaire. On distingue l’examen direct ‘natif ‘ou ‘à frais’ (par exemple pour les parasites), l’examen sur fond noir (spirochètes) et diverses colorations (bleu de méthylène, Gram, Ziehl, …). Le Gram est la coloration la plus usitée en bactériologie. L’examen direct permet de préciser la forme des bactéries et leur arrangement, et lors de coloration de Gram, de préciser le type de paroi, permettant une classification présomptive
Principe
Gram
Cette méthode diagnostique, inventée en 1884 par le microbiologiste danois Hans Christian Gram, repose sur l’application de colorants sur des prélèvements de liquides ou tissus biologiques de patients selon un principe de coloration, décoloration, recoloration. En fonction de la structure de leur paroi, les bactéries analysées vont se colorer différemment. Les résultats de cette méthode vont donc permettre de classer les bactéries en 2 groupes: les bactéries uni-membranées Gram + (violettes) vs. bactéries bi-membranées Gram – (roses)
Ziehl
Cette coloration comprend également les trois étapes coloration, décoloration, recoloration mais repose cette fois sur le principe d’acido-alcoolo résistance des mycobactéries.
Technique/ Méthode
1) La première étape est de récolter l’échantillon adéquat. Le type de prélèvement varie en fonction de ce que l’on suspecte chez le patient. On peut avoir: des expectorations, des selles, du LCR, du sang, du liquide synovial…
2) L’échantillon est ensuite transféré au laboratoire accompagné d’un bon de demande complété par le médecin précisant le l’identité du patient, le type de prélèvement et ce qui doit être recherché.
3) Arrivé au laboratoire, le prélèvement est étalé et fixé sur une lame, on ajoute sur cette lame du colorant violet (crystal violet) qui va se lier au peptidoglycane de la paroi bactérienne, ensuite on procède au « mordançage par ajout de lugol, le tout est décolorée à l’alcool. Pour finir, on fait une contre-coloration en appliquant un colorant rose (safranine). Les bactéries qui ont résisté à la décoloration (peptidoglycane épais), seront colorées en violet et donc classées parmi les bactéries Gram positives. Les bactéries qui ont été décolorées (peptidoglycane mince) seront contre-colorées en rose-rouge, ce sont donc les bactéries Gram négatives.
3) Comme pour la coloration de Gram, une première coloration (carbofuschine) est suivie par une étape de décoloration (par de l’HCl-alcool), puis une étape de contre coloration (bleu de méthylène). Les mycobactéries, acido-alcoolo résistantes resteront colorées en rose, alors que les autres, seront contre-colorées en bleu. Cette coloration s’effectue à chaud.
4) Visualisation au microscope
Applications
La coloration de Gram est la coloration la plus fréquemment utilisée en microbiologie. Elle est particulièrement utile pour la recherche de bactéries et de levure.
La coloration de Ziehl–Neelsen vise à la recherche de mycobactéries. C’est une coloration classique célèbre pour la mise en évidence de Mycobacterium tuberculosis, largement étudiée dans le domaine de la santé, dans les sciences médicales et vétérinaires. Il existe des colorations alternatives, comme l’auramine plus largement usitée de nos jours.
Avantages/ Inconvénients
Les plus:
- Méthode rapide et peu couteuse
- Lecture simple permettant d’attester de la qualité de l’échantillon et d’orienter le diagnostic
Les moins:
- Demande une expertise technique
- Sensibilité dépendant du prélèvement et de la charge bactérienne, sensibilité < aux méthodes de culture
Les plus:
- Méthode simple et rapide
- Quantification: permet facilement d’évaluer la contagiosité du patient en fonction du nombre de BAAR (bacilles acido-alcoolo-résistants) vus par champ microscopique
- Très spécifique
- Examen peut rester contributif au diagnostic de la tuberculose même si prise d’antibiotiques
Les moins:
- Demande une expertise technique
- Toxicité des colorants lorsqu’ils sont utilisés à chaud (vapeurs).
- Sensibilité inférieure en comparaison à la coloration fluorescente à l’auramine, à la culture et aux méthodes de diagnostic moléculaire.