PCR classique / PCR test rapide
Principe
Cette technique permet l’amplification in vitro d’une séquence cible d’ADN. La PCR permet d’obtenir un grand nombre de copies du matériel génétique du pathogène recherché, parfois présent en très petit nombre dans l’échantillon de départ. Il s’agit d’une méthode de biologie moléculaire.
Technique
On procède d’abord à l’étape d’extraction visant à isoler et purifier le matériel génétique présent dans l’échantillon. Ensuite, la technique PCR à proprement parler peut commencer. Elle comprend plusieurs cycles qui, eux-même, comportent chacun trois étapes ayant des températures différentes : une première étape de dénaturation (~95°C) permet, lors de l’étape suivante, l’hybridation (50-65°C) des amorces d’ADN spécifiques à la séquence cible. Enfin, le travail de l’ADN polymérase s’effectue lors de la dernière étape, l’élongation (~72°C). Celle-ci synthétise la séquence d’oligonucléotides cible. Ainsi, à chaque cycle il y a dédoublement des séquences d’ADN cibles.
Indication et application
La PCR est utilisée dans le diagnostic clinique de nombreuses pathologies infectieuses.
Sa sensibilité et sa spécificité dépendent des pathogènes recherchés et de la technologie utilisée.
Avantages
- Méthode rapide (2 à 3 heures pour une PCR de 40-45 cycles)
- Parfois plus sensible que d’autres techniques de diagnostic (culture, test antigénique)
- Utilisée lorsque la culture est lente, fastidieuse voire impossible
Inconvénients
- Technique plus coûteuse que la culture bactérienne classique ou la sérologie
- Selon le type de PCR, la méthode n’est pas valide pour tous les prélèvements
- Risque de contamination importante (nécessite une séparation physique entre les phases pré- et post-PCR)
- Si une mutation survient au niveau de la séquence cible, la sensibilité du test peut en être fortement diminuée.
Type de PCR
- qPCR: méthode quantitative qui rend un résultat de l’amplification au fur et à mesure des cycles par mesure de la fluorescence en temps réel.
- PCR multiplex: technique utilisée pour amplifier plusieurs cibles à la fois. L’utilisation de min. 1 couple d’amorces/sonde est nécessaires par cible.
- RT-PCR: technique permettant d‘amplifier une séquence d’ARN. Pour cela, une étape préalable consiste à traduire la séquence d’ARN en ADN via une enzyme appelée transcriptase inverse (issue d’un retrovirus).
Anecdotes
- La Taq polymérase est une enzyme issue d’une bactérie Gram négatif thermophile vivant à proximité de sources chaudes, Thermus aquaticus (d’où son nom). C’est le microbiologiste Thomas Brock qui la découvre dans une source d’eau chaude dans le parc de Yellowstone en 1966. C’est grâce à sa résistance aux hautes températures que la Taq polymérase est utilisée pour la dénaturation de la PCR.
- En 1985, le Dr Kary Mullis reçoit le prix Nobel de chimie pour avoir inventé la PCR.
PCR test rapide
Aujourd’hui, de nombreux modèles d’automates de PCR ont été développés afin d’améliorer la rapidité de l’analyse mais également de simplifier la technicité requise. Ces nouveaux modèles regroupent en un seul geste les différentes étapes de la PCR. Dès lors, cette technique peut être réalisée par du personnel non expérimenté et en dehors des murs du laboratoire.
Ces nouveaux modèles ont été très exploités lors de l’épidémie au COVID-19 pour améliorer la prise en charge des patients et diminuer le propagation du virus.
Références
- Jaton, K., Greub, G. (2007). ‘PCR en microbiologie : de l’amplification de l’ADN à l’interprétation du résultat’, Rev Med Suisse 2007; volume -7. no. 106, 931 – 938