Certaines bactéries sont difficiles voire impossibles à classer en Gram positif ou enGram négatif. En effet, certaines bactéries ne prennent pas la coloration de Gram soit parce qu’elles n’ont pas de paroi comme les Mollicutes, soit parce qu’elles ont une paroi mais modifiée, comme les Mycobactéries. Ces dernières ont une paroi riche en acides mycophénoliques. D’autres bactéries ne sont pas cultivables avec les méthodes classiques soit parce qu’elles sont fastidieuses, c’est-à-dire qu’elles demandent plus de temps ou un milieu particulier, comme Brucella, soit parce qu’elles sont non cultivables comme Treponema, ou sont strictement intracellulaires  comme les Coxiella, Bartonella, Anaplasma, Rickettsia, Legionella, ou Chlamydia. Akkermansia a été placée ici bien que Gram négatif car il ne s’agit pas d’un pathogène mais d’un probiotique.